qRT-PCR相对定量计算详解 qPCR

实时定量PCR也365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口组结合,计算表达量等等;


做完365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口组分析之后,一般都要求做qRT-PCR来验证二代测序得到的365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口本表达是否可靠。荧光定量PCR是一种相对表达定量的方法,他的计算方法有很多,常用的相对定量数据分析方法有双标曲线法,ΔCt法,2^-ΔΔCt法(Livak法),用参照基因的ΔCt法和Pfaffl法。这里主要讲解常用的2^-ΔΔCt法(Livak法)如何计算;

qRT-PCR原理:

以基因的cDNA为模板进行PCR扩增,在PCR扩增过程中,通过收集荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以可以定量。

Ct值是什么意思呢?

Ct 值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。 qRT-PCR在扩增的时候都会有平台期,在平台期之前,PCR 扩增就是简单的指数增长,也就是 1 变 2,2 变 4,4 变 8 …扩增。数学形式就是 2 的 ct 次方,到了平台期所有基因扩增的数目是一致的,而唯一有区别的则是 ct 值的不同。所以不难推断出 ct 值越小,反应扩增到达平台期所需循环数越少,目的基因起始含量越高。这里可以得到公式:



attachments-2018-09-vqhexX0o5ba38dce3d01f.jpg


attachments-2018-09-dBpJOkqj5ba38e0ee615e.jpg

计算-ΔΔCt

在这里,我们有一个对照组,一个处理组,还有一个内参基因和目的基因,想看一下目的基因在处理组中相对与对照中的表达差异,也就是计算-ΔΔCt:数据如下:

attachments-2018-09-YnSMN3575ba38e1b7e42a.jpg

1.计算每组内参基因sgAction Ct均值

attachments-2018-09-jKC4iwua5ba38e25ba9a1.jpg

  1. 计算第一个 Δct,即每组的待检目的基因减去内参基因的 Ct 值


attachments-2018-09-XQtn8fVc5ba38e2ebab2e.jpg

3.计算对照CK组中 Δct 的均值,再用处理组的 每一个Δct 减去刚刚计算的对照CK组的 Δct 均值,得到 ΔΔct(红框框)


attachments-2018-09-UqBDc8BY5ba38e373ad38.jpg

4.相对表达量计算,也就是相对于对照组: 2^-ΔΔct:

attachments-2018-09-oiwwvPX25ba38e47a3568.jpg

不难看出这里的-ΔΔct和我们365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口组当中的log2(fold change)值是一致的,所以如果多做几个基因就可以绘制类似如下图:

attachments-2018-09-mxgH7WkI5ba38e5019b7a.jpg

或者相关性点图:

attachments-2018-09-8KBvnfRL5ba38e59ed3f8.jpg


测试数据表格下载:qRT-PCR_demo_data.xlsx


更多生物信息课程:

1. 文章越来越难发?是你没发现新思路,基因家族分析发2-4分文章简单快速,学习链接:基因家族分析实操课程基因家族文献思路解读

2. 365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口组数据理解不深入?图表看不懂?点击链接学习深入解读数据结果文件,学习链接:365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口组(有参)结果解读365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口组(无参)结果解读

3. 365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口组数据深入挖掘技能-WGCNA,提升你的文章档次,学习链接:WGCNA-加权基因共表达网络分析

4. 365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口组数据怎么挖掘?学习链接:365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口组标准分析后的数据挖掘365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口组文献解读

5.?微生物16S/ITS/18S分析原理及结果解读OTU网络图绘制cytoscape与网络图绘制课程

6. 生物信息入门到精通必修基础课:linux系统使用biolinux搭建生物信息分析环境linux命令处理生物大数据perl入门到精通perl语言高级R语言画图R语言快速入门与提高

7. 医学相关数据挖掘课程,不用做实验也能发文章:TCGA-差异基因分析GEO芯片数据挖掘?GEO芯片数据不同平台标准化?、GSEA富集分析课程TCGA临床数据生存分析TCGA-365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口因子分析TCGA-ceRNA调控网络分析

8.其他,二代测序365bet日博官网_外围365bet_365bet足球盘口组数据自主分析NCBI数据上传二代fastq测序数据解读

9.全部课程可点击:组学大讲堂视频课程


  • 发表于 2018-09-20 20:11
  • 阅读 ( 22046 )
  • 分类:实验相关

0 条评论

请先 365bet日博官网 后评论
omicsgene
omicsgene

生物信息

240 篇文章

作家榜 ?

  1. omicsgene 240 文章
  2. 安生水 207 文章
  3. Daitoue 165 文章
  4. 生物女学霸 83 文章
  5. landy 37 文章
  6. 组学生物-王运斌 33 文章
  7. 红橙子 32 文章
  8. omics007 22 文章